Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IIF) trên tế bào HEp-2 là một phương pháp sàng lọc quan trọng và tiêu chuẩn vàng để phát hiện tự kháng thể không đặc hiệu cơ quan (Non-organ Specific Autoantibodies - AABs). Các tự kháng thể này được định hướng kháng lại các kháng nguyên được bảo tồn cao của tế bào cơ thể.

Giao thức đồng thuận (Consensus protocol) được thiết kế để chuẩn hóa các quy trình chẩn đoán và cải thiện khả năng so sánh kết quả giữa các phòng xét nghiệm, đặc biệt trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh tự miễn.

1. Các khía cạnh chung và đặc điểm lâm sàng

Tự kháng thể không đặc hiệu cơ quan, chủ yếu là kháng thể kháng nhân (ANA), có vai trò chẩn đoán quan trọng trong các bệnh mô liên kết và bệnh gan tự miễn.

Ban đầu, các lát cắt mô đông lạnh từ các cơ quan được sử dụng làm cơ chất, nhưng hiện nay, các tế bào HEp-2, một dòng tế bào biểu mô có nguồn gốc từ ung thư biểu mô thanh quản người, đã thay thế chúng.

Ưu điểm chính của IIF trên tế bào HEp-2 trong sàng lọc ban đầu là nó cung cấp cái nhìn tổng quan tốt về hầu hết các AABs không đặc hiệu cơ quan có liên quan đến chẩn đoán và nồng độ của chúng.

2. Thuốc thử và chuẩn bị xét nghiệm            

Tế bào HEp-2:

• Tế bào HEp-2 có sẵn từ nhiều nhà cung cấp dưới dạng thiết bị chẩn đoán được chứng nhận CE và/hoặc FDA.
• Chất lượng của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy, chuẩn bị tế bào, chuẩn bị lam kính hiển vi, cố định và hướng dẫn xử lý.
• Các tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng tế bào bao gồm: mật độ và sự phân bố tế bào trên lam kính hiển vi, số lượng phân bào (ít nhất 3-5 phân bào trên mỗi trường nhìn ở độ phóng đại 200×), sự biểu hiện của các kháng nguyên đích cho các tự kháng thể liên quan, duy trì hình thái và huỳnh quang nền.
• Mỗi lô tế bào cần được kiểm tra chất lượng bằng các quy trình giám sát định nghĩa, sử dụng một huyết thanh âm tính và ít nhất ba mẫu huyết thanh dương tính với các kiểu huỳnh quang khác nhau. Việc tiêu chuẩn hóa quy trình sản xuất tế bào HEp-2 và thành phần bộ kit xét nghiệm là cần thiết để đảm bảo sự đồng nhất trong kết quả.

Nơi làm việc:

• Việc chuẩn bị xét nghiệm IIF và đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh quang thường được thực hiện ở các khu vực riêng biệt.
• Điều quan trọng là phải đảm bảo mức độ bụi thấp trong phòng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang. Phòng soi kính hiển vi cần đủ lớn cho hai người làm việc đồng thời và được thông gió đầy đủ.

Quy trình xét nghiệm:

• Tất cả các mẫu phải luôn được nhận dạng bằng thông số kỹ thuật và nhãn mẫu.
• Các quy trình trước phân tích không quan trọng đối với việc phát hiện tự kháng thể. Tuy nhiên, huyết thanh tán huyết, có lipid và vàng da cần được ghi lại vì chúng có thể ảnh hưởng đến hệ thống xét nghiệm.
• Các xét nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng (20˚C−24˚C).
• Các giai đoạn ủ cần được thực hiện trong buồng ẩm để bảo vệ mẫu khỏi bị khô.
• Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng bằng dung dịch đệm (thường là dung dịch saline đệm phosphat, hoặc PBS), sau đó thêm vào lớp tế bào HEp-2 đơn lớp. Thời gian ủ thường là 30 phút, sau đó rửa ba lần, mỗi lần 10 phút bằng PBS.
• Việc sử dụng kháng thể thứ cấp được dán nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) đối với IgG người rất phổ biến. Các kháng thể thứ cấp dán nhãn FITC thường được xử lý bằng Evans Blue (0.01 g/lL) để tín hiệu huỳnh quang dễ phân biệt hơn.
• Sau khi thêm kháng thể thứ cấp và ủ, lam kính được rửa lại. Cuối cùng, lam kính hiển vi được phủ một môi trường gắn kết có chứa glycerine (khoảng 80% glycerine trong PBS), thường chứa chất chống phai màu.

Pha loãng huyết thanh:

• Pha loãng huyết thanh 1:80 được sử dụng trong sàng lọc kháng thể. Hầu hết các bộ kit được thiết kế sao cho 95% huyết thanh từ người khỏe mạnh không bị nhuộm màu.
• Trong trường hợp kết quả dương tính, xét nghiệm được lặp lại bằng cách sử dụng chuỗi pha loãng hình học theo cường độ huỳnh quang ban đầu (1:160−1:5,120).
• Mức hiệu giá ít nhất 1:160 được coi là có ý nghĩa chẩn đoán. Hiệu giá 1:80 có thể được coi là ranh giới, vì trong đa số các trường hợp với hiệu giá này, không tìm thấy các đặc hiệu ANA có ý nghĩa chẩn đoán.

3. Soi kính hiển vi

Việc đánh giá kiểu huỳnh quang chính xác được thực hiện ở độ phóng đại 400× (kết hợp thị kính 10× và vật kính 40×). Cường độ huỳnh quang cần được đánh giá, và việc đánh giá phải tính đến nhiều phân bào để đưa ra quyết định rõ ràng về sự hiện diện hoặc vắng mặt của huỳnh quang cũng như kiểu cơ bản.

Nguồn sáng từ điốt phát quang (LEDs) ngày càng được sử dụng nhiều hơn thay cho đèn thủy ngân hơi, do độ sáng ổn định và tuổi thọ dài (hơn 10.000 giờ).

4. Đánh giá và diễn giải

Tế bào HEp-2 chứa một phổ rộng các tự kháng nguyên có thể phát hiện được. Mặc dù chủ yếu chú ý đến các kiểu nhân, các kiểu tế bào chất cũng cần được xem xét. Các kiểu kết hợp là phổ biến.

• Tất cả các kiểu huỳnh quang riêng lẻ phải được chỉ định trong báo cáo, với thông tin chi tiết về các hiệu giá khác nhau nếu phù hợp.
• Một số kiểu huỳnh quang trong IIF chỉ ra các đặc hiệu AAB có liên quan đến bệnh và là một dấu hiệu để sử dụng các xét nghiệm miễn dịch đặc hiệu.
• Trong các trường hợp không thể xác định rõ hơn các kiểu huỳnh quang và ý nghĩa lâm sàng của chúng chưa rõ, cần có một ghi chú để thông báo cho bác sĩ lâm sàng về kiểu đó.
• Các tự kháng thể kháng nhân được chia thành một vài kiểu cơ bản. Các kiểu này thường tồn tại dưới dạng kiểu hỗn hợp, có thể được phân biệt thông qua quan sát ở các độ pha loãng khác nhau.
• Việc đánh giá phải được thực hiện bởi các nhân viên có kinh nghiệm, những người thường xuyên được đào tạo thêm về quy trình chẩn đoán tự miễn.
• Các xét nghiệm sàng lọc cần được tiếp theo bằng các quy trình chẩn đoán sâu hơn dựa trên các xét nghiệm miễn dịch đặc hiệu (xét nghiệm miễn dịch phóng xạ, enzyme, hoặc chấm/dòng) sử dụng các tự kháng nguyên có độ tinh khiết cao.
• Báo cáo chẩn đoán phải bao gồm các kháng nguyên đích có thể có, mô tả các kiểu huỳnh quang tìm thấy và hiệu giá của chúng, và quan trọng nhất là đánh giá các phát hiện dưới góc độ các câu hỏi chẩn đoán.

Kỹ thuật IIF trên tế bào HEp-2 giống như một "bản đồ kho báu" cho các nhà khoa học và bác sĩ, giúp họ xác định vị trí và nồng độ của các "dấu hiệu" tự miễn dịch trong cơ thể bệnh nhân. Việc chuẩn hóa quy trình này đảm bảo rằng tất cả mọi người sử dụng cùng một bản đồ và phương pháp đọc, từ đó giúp họ tìm ra "kho báu" (chẩn đoán chính xác) một cách hiệu quả và đáng tin cậy hơn.

                          Nguồn: Autoimmune Diagnostics-De Gruyter (2012) (Harald Renz (editor))