Phân tích tự kháng thể đa tham số: một giải pháp mới để chẩn đoán bệnh mô liên kết

Nghiên cứu về "Phân tích tự kháng thể đa tham số: một giải pháp mới để chẩn đoán bệnh mô liên kết" của tác giả Elena Bartoloni và Roberto Gerli đã làm rõ về vai trò của việc xét nghiệm các tự kháng thể cùng một lúc trong việc chẩn đoán sớm bệnh mô liên kết.

1. Tóm tắt

1.1. Bối cảnh nghiên cứu

Ở những bệnh nhân bị bệnh mô liên kết (CTD), việc xác định các bộ tự kháng thể mở rộng có thể hữu ích trong chẩn đoán sớm, trong đánh giá tiên lượng (phân tầng nguy cơ) và trong dự đoán đáp ứng với liệu pháp. Mục đích của nghiên cứu hiện tại là đánh giá tính hữu ích của phân tích tự kháng thể đa tham số được thực hiện bởi hệ thống sử dụng công nghệ đa phân tích dựa trên hạt hoàn toàn tự động (PMAT: particle-based multi-analyte technology) trong một nhóm bệnh nhân CTD và nhóm đối chứng lớn.

1.2. Phương pháp

Các mẫu huyết thanh từ 787 bệnh nhân mắc CTD (166 bệnh lupus ban đỏ hệ thống; 133 bệnh xơ cứng hệ thống; 279 hội chứng Sjögren; 106 bệnh cơ viêm vô căn; 103 bệnh CTD không phân biệt), 339 bệnh nhân mắc các rối loạn khác (đối chứng bệnh) (118 bệnh truyền nhiễm, 110 bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan, 111 bệnh thấp khớp khác) và 121 đối tượng khỏe mạnh đã được thu thập tại 13 trung tâm thấp khớp của nhóm FIRMA (Diễn đàn liên ngành nghiên cứu về bệnh tự miễn dịch Malattie). Huyết thanh được phân tích bằng thiết bị Aptiva-PMAT (Inova Diagnostics) để tạo thành nhóm 29 kháng thể tự miễn.

1.3. Kết quả

Phân tích hồi quy logistic đa tham số cho thấy bộ tự kháng thể mở rộng có hiệu quả chẩn đoán cao hơn so với bộ tự kháng thể riêng lẻ hoặc bộ tự kháng thể tạo nên tiêu chí phân loại cho một bệnh nhất định và khả năng mắc bệnh tăng lên với nhiều kháng thể tự miễn dương tính.

1.4. Kết luận

Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích tác động lâm sàng và chẩn đoán của bộ tự kháng thể trong CTD. Các kết quả thu được bằng phương pháp Aptiva-PMAT có thể mở ra những góc nhìn thú vị trong chẩn đoán và phân loại phụ cho bệnh nhân mắc bệnh thấp khớp tự miễn.

2. Đặt vấn đề

Bệnh mô liên kết (CTD) là một nhóm các rối loạn không đồng nhất, liên quan đến nhiều hệ thống cơ thể. Kháng thể kháng nhân (ANA) có thể liên quan đến nhiều CTD khác nhau, bao gồm lupus ban đỏ hệ thống (SLE), hội chứng Sjögren nguyên phát (pSS), xơ cứng bì hệ thống (SSc), bệnh cơ viêm vô căn (IIM), bệnh mô liên kết hỗn hợp (MCTD) và bệnh mô liên kết không phân biệt (UCTD).

Vì những bệnh này, đặc biệt là trong giai đoạn đầu, có thể có nhiều đặc điểm lâm sàng chồng chéo và do đó không dễ phân biệt chỉ dựa trên các triệu chứng, nên các đặc điểm ANA là các dấu ấn sinh học quan trọng để chẩn đoán phân biệt. Vì lý do này, một số ANA cụ thể được đưa vào tiêu chí phân loại CTD, chẳng hạn như anti-Ro60 đối với pSS [ 1 ], anti-topoisomerase I (còn được gọi là Scl70), anti-centromere B protein (CENP-B) và anti-RNA polymerase III (RNA pol III) đối với SSc [ 2 ]; anti-histidyl tRNA synthetase (Jo1) cho IIM [ 3 ]; anti-U1 RNP cho MCTD [ 4 ]; và anti-dsDNA cũng như anti-Sm cho SLE [ 5 ].

Ngoài ra, ANA đại diện cho tiêu chí đầu vào trong tiêu chí phân loại SLE năm 2019 của Liên đoàn chống thấp khớp châu Âu/Học viện thấp khớp Hoa Kỳ (EULAR/ACR) [ 5 ]. Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là ANA không chỉ hữu ích để phân loại CTD mà còn chẩn đoán bệnh ở giai đoạn rất sớm, khi bệnh nhân có thể được hưởng lợi từ can thiệp điều trị sớm.

Trong khi vai trò gây bệnh của ANA vẫn chưa rõ ràng, ở một số CTD, như trong SSc và IIM, ANA cụ thể không chỉ đại diện cho các công cụ chẩn đoán quan trọng mà còn giúp phân tầng bệnh nhân thành các phân nhóm có các đặc điểm lâm sàng, phản ứng điều trị và kết quả bệnh khác nhau [ 6 , 7 , 8 , 9 ]. Cuối cùng, mức độ anti-dsDNA có tương quan với hoạt động của SLE, đặc biệt là liên quan đến tình trạng thận [ 10 ], khiến việc phát hiện và đo lường định lượng các kháng thể như vậy có liên quan trong việc theo dõi quá trình bệnh [ 11 ].

Theo truyền thống, xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp sử dụng tế bào biểu mô loại 2 của người (HEp-2 IFA) có độ nhạy cao và là xét nghiệm sàng lọc thường được sử dụng đối với ANA. Trong trường hợp kết quả ANA dương tính, các xét nghiệm tuyến hai được thực hiện để xác định kháng nguyên mục tiêu [ 12 ] bằng cách sử dụng các xét nghiệm pha rắn, chẳng hạn như xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme, xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme huỳnh quang hoặc xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang [ 13 , 14 ].

Tuy nhiên, nhu cầu xét nghiệm số lượng kháng thể đặc hiệu ngày càng tăng đòi hỏi phải sử dụng xét nghiệm miễn dịch ghép kênh. Vì mục đích này, các thiết bị cho phép phát hiện đồng thời nhiều tự kháng thể đã được phát triển và được sử dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng [ 15 , 16 ]. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này chỉ cho phép phát hiện một số lượng tự kháng thể hạn chế, thường từ tám đến mười hai.

Gần đây, một hệ thống kỹ thuật số hoàn toàn tự động sử dụng công nghệ đa phân tích dựa trên hạt (PMAT) đã được phát triển. Trong xét nghiệm ghép kênh này, mỗi tự kháng nguyên khác nhau được liên kết với một hạt duy nhất. Sau khi ủ mẫu bệnh nhân, liên kết kháng thể được phát hiện bởi một hệ thống dựa trên camera, do đó cho phép phát hiện đồng thời nhiều đặc hiệu tự kháng thể. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh độ chính xác tốt của PMAT trong việc phát hiện nhiều kháng thể trong các bệnh tự miễn, chẳng hạn như viêm mật mật nguyên phát [ 17 ], IIM [ 18 , 19 , 20 ] và hội chứng kháng phospholipid (APS) [ 21 , 22 , 23 ].

Đặc biệt, bảng PMAT được thiết kế cho các tự kháng thể kháng phospholipid cho phép xác định những bệnh nhân nghi ngờ mắc APS không đáp ứng các tiêu chí phân loại bệnh bằng cách phát hiện đồng thời nhiều kháng thể kháng phospholipid, bao gồm kháng thể kháng beta 2 glycoprotein I domain I và kháng thể kháng phosphatidylserine/prothrombin [ 21 , 23 ]. Ở những bệnh nhân mắc IIM, PMAT cho thấy sự phù hợp tốt với xét nghiệm kết tủa miễn dịch, đây là phương pháp tham chiếu để phát hiện kháng thể đặc hiệu viêm cơ (MSA) và có độ chính xác cao hơn xét nghiệm miễn dịch dòng [ 18 ].

Những kết quả sơ bộ này cho thấy phương pháp mới này có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời nhiều kháng thể tự miễn, cải thiện cả khả năng chẩn đoán và phân tầng nguy cơ ở bệnh nhân theo mức độ kháng thể dương tính. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào phân tích hiệu suất của PMAT trong việc phát hiện nhiều kháng thể trong CTD.

Do đó, mục tiêu của nghiên cứu hiện tại là đánh giá hiệu suất chẩn đoán của hệ thống PMAT trong việc phát hiện số lượng lớn các tự kháng thể liên quan đến CTD trong một nhóm bệnh nhân mắc CTD, so với nhóm đối chứng mắc bệnh truyền nhiễm, bệnh nhân mắc bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan, bệnh nhân mắc các bệnh thấp khớp khác và những người khỏe mạnh.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Bệnh nhân

Các mẫu huyết thanh từ 1247 đối tượng được thu thập tại 13 trung tâm thấp khớp học khác nhau của Ý thuộc nhóm FIRMA (Diễn đàn liên ngành nghiên cứu về bệnh tự miễn dịch Malattie) đã được phân tích trong nghiên cứu này. Chuỗi nghiên cứu bao gồm 787 bệnh nhân mắc CTD được phân loại theo các tiêu chí được quốc tế chấp nhận (701 nữ/86 nam; độ tuổi trung bình 41,3; độ tuổi từ 16–88): 166 SLE, 133 SSc (52 lan tỏa da và 81 giới hạn da), 279 pSS, 106 IIM và 103 UCTD dương tính với ANA.

Nhóm đối chứng (460 đối tượng; 293 nữ/167 nam; tuổi trung bình 45,9; độ tuổi dao động 5–88) bao gồm 339 đối chứng bệnh: 118 mẫu từ các đối tượng mắc bệnh truyền nhiễm (27 virus viêm gan C, 21 virus Epstein-Barr, 22 cytomegalovirus, 25 virus viêm gan B và 23 bệnh giang mai), 110 mẫu từ bệnh nhân mắc bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan (25 bệnh tuyến giáp tự miễn, 25 bệnh celiac, 30 viêm mật đường mật nguyên phát và 30 viêm dạ dày tự miễn), 111 mẫu từ bệnh nhân mắc các bệnh thấp khớp khác (15 viêm khớp dạng thấp, 23 đau đa cơ dạng thấp, 17 đau xơ cơ, 36 viêm cột sống dính khớp, 17 viêm khớp vảy nến, 3 thoái hóa khớp) và 121 mẫu từ các đối tượng khỏe mạnh (người hiến máu).

Số lượng mẫu cần thu thập được xác định dựa trên tỷ lệ lưu hành đã biết của các kháng thể khác nhau trong các CTD khác nhau [ 24 ], để có số lượng mẫu dương tính với từng kháng thể quan trọng nhất, đủ để có được ý nghĩa thống kê. Trong nhóm CTD, 15% là chẩn đoán đầu tiên và 85% là bệnh nhân đang theo dõi; khoảng thời gian trung bình từ khi chẩn đoán là 7,7 năm (phạm vi 0–43).

ANA HEp-2 IFA (thực hiện tại từng vị trí riêng lẻ) có kết quả dương tính ở mức chuẩn độ 1:80 ở 164/166 (98,8%) SLE, ở 131/133 (98,5%) SSc, ở 249/279 (89,2%) pSS, ở 84/106 (79,2%) IIM và ở 207/460 (45,0%) đối chứng. Tất cả bệnh nhân UCTD đều có kết quả dương tính với ANA theo tiêu chí lựa chọn.

Các mẫu được mã hóa bởi các trung tâm tuyển dụng và các phân tích huyết thanh được thực hiện mà không cần biết dữ liệu lâm sàng.

Đối với mỗi bệnh nhân, dữ liệu nhân khẩu học và lâm sàng được ghi lại theo bệnh lý cụ thể. Tất cả dữ liệu được nhập vào cơ sở dữ liệu và phân tích.

3.2. Phương pháp

Huyết thanh đã được thử nghiệm trên thiết bị Aptiva™ (Inova Diagnostics, San Diego, CA; Chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu). Aptiva là một hệ thống tự động kỹ thuật số sử dụng công nghệ đa phân tích dựa trên hạt (PMAT) để đo đồng thời nhiều tự kháng thể trong một bước duy nhất. Công nghệ này dựa trên việc sử dụng hỗn hợp các vi hạt lơ lửng có mã màu duy nhất, được phủ riêng lẻ bằng một kháng nguyên khác nhau. Mỗi mã màu duy nhất cho phép xác định kháng nguyên trong quy trình. Sau khi ủ với huyết thanh của bệnh nhân đã pha loãng, các hạt được rửa và ủ với kháng thể IgG của người liên hợp với phycoerythrin.

Cuối cùng, sau một chu kỳ rửa khác, các hạt được căn chỉnh thành một lớp đơn và được phân tích thông qua công nghệ hình ảnh kỹ thuật số sử dụng hai đèn LED. Đèn LED màu đỏ đầu tiên được sử dụng để xác định chất phân tích, trong khi đèn LED màu xanh lá cây thứ hai cho phép đo cường độ huỳnh quang. Dữ liệu phản ứng được thu thập dưới dạng kỹ thuật số bởi cảm biến thiết bị ghép nối tích điện (CCD) có độ phân giải cao tinh vi. Hình ảnh thu được sau đó được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu của máy phân tích để tính toán và công bố kết quả định lượng. Để xác minh chức năng chính xác của thiết bị, hệ thống sử dụng các mẫu kiểm chuẩn chất lượng có chứa kháng thể đặc hiệu cho từng chất phân tích được thử nghiệm.

3.3. Bộ tự kháng thể

Các mẫu được tập trung tại Phòng thí nghiệm Pordenone của nhóm FIRMA và được thử nghiệm với ba nhóm kháng nguyên đa tham số sau: CTD IgG Essential™ (dsDNA, DFS70, U1 RNP, Sm, Ro60, Ro52, La, Scl70, Jo1, CENP-B, Ribo-P), CTD IgG Comprehensive™ (RNA pol III, Th/To, Ku, BICD2, PM/Scl) và Autoimmune Myopathy IgG™ (Mi-2, HMGCR, NXP2, MDA5, PL-7, PL-12, EJ, SRP, TIF1γ, SAE e OJ).

Thiết bị Aptiva sử dụng hộp thuốc thử đã sẵn sàng chứa tất cả các thuốc thử cụ thể cho phản ứng phân tích, bao gồm hỗn hợp các vi cầu được phủ các kháng nguyên khác nhau được xác định trong mỗi cấu hình.

3.4. Phân tích thống kê

Ngưỡng cắt tối ưu cho mỗi một trong ba nhóm kháng thể (CTD thiết yếu, CTD toàn diện và Bệnh cơ tự miễn) được lựa chọn bằng cách phân tích đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC) và đặt ở mức 5 đơn vị tùy ý (AU)/ml đối với các kháng thể có trong bộ CTD thiết yếu và 1 AU cho cả nhóm Viêm cơ toàn diện và Viêm cơ tự miễn.

Độ nhạy chẩn đoán của từng kháng thể được tính riêng trong CTD khác nhau; độ đặc hiệu chẩn đoán được tính trong nhóm đối chứng (nhóm đối chứng bệnh và đối tượng khỏe mạnh). Ngoài ra, xét đến việc Aptiva cũng cung cấp chức năng sàng lọc, cho biết tất cả các kháng thể được tìm kiếm đều âm tính hay ít nhất một trong số chúng là dương tính, chúng tôi đã tính toán độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán tích lũy của tất cả các kháng thể có trong ba bộ trên toàn bộ quần thể CTD.

Phân phối của các biến đầu tiên được kiểm tra bằng kiểm định Shapiro–Wilk và vì tất cả dữ liệu đều không phân phối chuẩn nên kiểm định Mann–Whitney U được sử dụng để so sánh các biến.

Các model hồi quy logistic hai biến và đa biến được điều chỉnh để dự đoán tình trạng bệnh nhân kết hợp vào các model cuối cùng các biến có ý nghĩa trong phân tích hai biến và các biến dự đoán lâm sàng chính. Để giảm độ lệch quá mức và xác nhận nội bộ kết quả của chúng tôi, tất cả các hồi quy đều được thực hiện 200 mẫu bootstrap và độ phù hợp của các model logistic đã được kiểm tra bằng cách sử dụng kiểm định Hosmer và Lemeshow. Độ chính xác dự đoán của các model hồi quy logistic được định lượng là diện tích (AUC) dưới đường cong ROC được xây dựng trên xác suất bệnh nhân là "trường hợp" hoặc "đối chứng" có được từ phương trình hồi quy logistic.

Để xác định xem một quan sát có nên được phân loại là dương tính hay âm tính hay không, chúng tôi đã chọn một điểm cắt sao cho các quan sát có xác suất được điều chỉnh trên điểm cắt được phân loại là dương tính và bất kỳ quan sát nào có xác suất được điều chỉnh dưới điểm cắt được phân loại là âm tính. AUC cho chúng ta biết model có thể phân biệt giữa kết quả dương tính và âm tính tốt như thế nào. Độ chính xác dự đoán dưới dạng AUC đã được so sánh bằng phương pháp DeLong.

4. Kết quả

4.1. Độ chính xác chẩn đoán của bộ tự kháng thể

Tỷ lệ kháng thể tự miễn (độ nhạy chẩn đoán của xét nghiệm PMAT) trong các nhóm bệnh khác nhau và độ đặc hiệu chẩn đoán của từng kháng thể tự miễn đối với các nhóm bệnh cơ CTD thiết yếu, CTD toàn diện và tự miễn được thể hiện trong Bảng 1

Trong số 166 bệnh nhân SLE, kháng thể tự miễn anti-dsDNA là phát hiện thường gặp nhất (58,4%), tiếp theo là Ro60 (54,5%), U1 RNP (41,6%) và Ro52 (30,3%). Kháng thể anti-Sm có mặt ở 14,5% bệnh nhân SLE. 16 bệnh nhân (9,4%) không có kháng thể phát hiện được.

Kháng thể anti-Ro60 (69,5%), anti-Ro52 (66,9%) và anti-La (49,5%) phổ biến ở hội chứng Sjögren [không phát hiện thấy kháng thể nào ở 58/279 (20,8%) bệnh nhân], trong khi ở 133 bệnh nhân SSc, anti-centromere (CENP-B) chiếm 50,8% và anti-Scl70 chiếm 34,1%. Khi SSc được chia thành hai phân nhóm lâm sàng, cụ thể là giới hạn ở da (lcSSc) và lan tỏa ở da (dcSSc), trong số 81 bệnh nhân có các đặc điểm lâm sàng của lcSSc, 75,3% dương tính với anti-CENP-B, 12,3% dương tính với anti-Scl70 và 1,2% dương tính với anti-RNA pol III. Trong số 52 bệnh nhân có các đặc điểm lâm sàng của dcSSc, kháng thể anti-Scl70 được phát hiện ở 68,6%, anti-RNA pol III ở 3,9% và anti-CENP-B ở 9,8%. Ở cả hai phân nhóm SSc, không có sự chồng chéo giữa kháng thể anti-CENP-B, Scl70 và anti-RNA pol III. 13 bệnh nhân SSc (9,8%) không có kháng thể.

Kháng thể đặc hiệu viêm cơ (MSA) được phát hiện ở 69/106 (65,1%) bệnh nhân mắc IIM; trong số đó, 26/69 (37,7%) dương tính với kháng thể kháng Jo1 (ở 11 bệnh nhân là kháng thể duy nhất). Mặc dù tỷ lệ mắc MSA khác dao động từ 1 đến 12,6% vì các tự kháng thể này gần như loại trừ lẫn nhau, nhưng độ đặc hiệu của chúng luôn vượt quá 99%. Bên cạnh MSA, kháng thể kháng Ro52 mặc dù không phải là MSA nhưng được biết là có liên quan đến IIM [ 25 ] đã được phát hiện ở 26/106 (24,5%) bệnh nhân; trong 13 trường hợp, chúng liên quan đến kháng thể kháng Jo1; trong ba trường hợp, với một MSA khác; và trong 10 trường hợp, chúng là kháng thể duy nhất.

Trong nhóm UCTD, anti-Ro60 là phát hiện thường gặp nhất (39,8%) tiếp theo là anti-Ro52 (24,3%), anti-dsDNA và anti-U1 RNP (cả hai đều là 18,4%). Tổng cộng 38/103 (36,9%) bệnh nhân UCTD có kết quả âm tính với tất cả các kháng thể.

4.2. Bộ tự kháng thể trong việc dự đoán chẩn đoán

Dựa trên những phát hiện này, sự kết hợp tốt nhất của các kháng thể tự miễn cho từng bệnh để dự đoán chẩn đoán đã được lựa chọn theo sức mạnh của độ chính xác chẩn đoán của chúng trong phân tích ROC. Các model hồi quy logistic đa biến được lắp vào mức kháng thể đã chứng minh sự kết hợp mạnh nhất của các kháng thể tự miễn cho từng nhóm bệnh lý.

Kháng thể đối với dsDNA ( p = 0,0001), U1 RNP ( p = 0,001), Ro60 ( p = 0,0001) và P ribosome ( p = 0,02) có liên quan đáng kể với SLE. AUC là 0,849 đối với dsDNA, 0,880 đối với U1 RNP, 0,837 đối với Ro60 và 0,729 đối với P ribosome. Khi các đường cong ROC được kết hợp với nhau bằng cách thêm một kháng thể nữa tại thời điểm đó, U1 RNP + dsDNA cung cấp AUC là 0,905 và khi thêm Ro60 hoặc P ribosome, AUC tăng lên 0,943 (Hình 1).

Việc bổ sung cả anti-Ro60 và anti-ribosome P đều không đạt được độ chính xác chẩn đoán (AUC 0,942) vì tất cả bệnh nhân có kháng thể anti-ribosome P cũng dương tính với anti-dsDNA hoặc với kháng thể U1 RNP hoặc Ro60. Tuy nhiên, mặc dù anti-ribosome P không làm tăng độ nhạy chẩn đoán, việc đưa kháng thể này vào bộ chẩn đoán là quan trọng vì tính đặc hiệu rất cao của nó đối với SLE và mối liên quan của nó với bệnh lupus thần kinh tâm thần [ 26 ]

Anti-Sm, mặc dù có độ đặc hiệu rất cao (99,8%) và liên quan đến SLE theo hồi quy logistic hai biến ( p <0,001), không góp phần làm tăng đáng kể chẩn đoán SLE theo phân tích hồi quy logistic đa biến ( p = 0,19). Điều này có thể dễ dàng giải thích được do độ nhạy thấp (14,5%) và vì kháng thể này chỉ được tìm thấy là kháng thể duy nhất trong một số ít trường hợp. Thật vậy, trong loạt bệnh nhân SLE này, anti-dsDNA được phát hiện ở 78% các trường hợp, anti-dsDNA + anti-Sm ở 20% và anti-Sm không có anti-dsDNA chỉ ở 2%.

Phân tích tương tự áp dụng cho các bệnh khác cho thấy trong hội chứng Sjögren có hai kháng thể có liên quan đáng kể đến: anti-Ro60 và anti-Ro52 ( p = 0,0001 và 0,001, tương ứng). Tuy nhiên, việc thêm anti-Ro52 (AUC 0,850) vào anti-Ro60 (AUC 0,837) chỉ cải thiện một chút độ chính xác của chẩn đoán (AUC 0,869). Mặc dù kháng thể anti-La cho thấy có liên quan đến pSS bằng hồi quy logistic hai biến ( p <0,001), nhưng mối liên quan của chúng với bệnh không được xác nhận bằng hồi quy bội (p = 0,238). Tuy nhiên, điều quan trọng là phải duy trì kháng thể anti-La trong bộ chẩn đoán vì khi kết hợp anti-Ro60 và anti-La, độ đặc hiệu đối với hội chứng Sjögren là cao (99,3% so với nhóm chứng và 93,4% so với SLE).

Trong bệnh xơ cứng hệ thống, kháng thể anti-CENP-B cho thấy mối liên quan chặt chẽ ( p = 0,0001) với lcSSc (81 bệnh nhân) và AUC là 0,902; trong dcSSc (52 bệnh nhân), AUC đối với anti-Scl70 là 0,874 ( p = 0,001). Kháng thể anti-RNA pol III và anti-U 1 RNP cũng có liên quan đáng kể với SSc ( p = 0,012 và p = 0,001, tương ứng). Đường cong ROC tổng hợp tạo nên bởi sự kết hợp của bốn kháng thể (anti-CENP-B, anti-Scl70, anti-RNA pol III và anti-U 1 RNP) mang lại giá trị AUC cao nhất (0,958) (Hình 2).

Trong nhóm bệnh cơ viêm vô căn, anti-HMGCR ( p = 0,019), anti-MDA5 ( p = 0,020), anti-NXP2 ( p = 0,020) và anti-Tif1γ ( p = 0,041) có liên quan đáng kể đến bệnh. Tất cả MSA kết hợp cung cấp AUC là 0,701. Khi anti-Jo1 (AUC tổng hợp 0,762) và anti-Ro52 được thêm vào, AUC tích lũy là 0,813 đã thu được (Hình 3).

Khi các kháng thể có trong ba bộ CTD được xem xét một cách tập thể và kết quả Aptiva được sử dụng làm xét nghiệm sàng lọc, độ nhạy chẩn đoán của bộ tự kháng thể hoàn chỉnh trong việc xác định CTD (loại trừ UCTD) là 85,7%, do đó cao hơn nhiều so với độ nhạy của bất kỳ kháng thể nào được lấy riêng lẻ và độ đặc hiệu là 87,5% (AUC tích lũy là 0,873). So với xét nghiệm ANA cổ điển, ở hiệu giá 1:80 HEp-2 IFA, Aptiva kém nhạy hơn (85,7% so với 91,8%) ( p = 0,0004) nhưng đặc hiệu hơn nhiều (77,0% so với 55%) ( p <0,0001). Ở nồng độ HEp-2 IFA 1:160, Aptiva nhạy hơn một chút (85,7% so với 82,5%), mặc dù không có ý nghĩa thống kê ( p = 0,215) và đặc hiệu hơn nữa (77,0% so với 65,6%) ( p = 0,0003).

4.3. Bộ tự kháng thể trong việc đánh giá khả năng mắc bệnh

Chúng tôi đã đánh giá thêm khả năng chẩn đoán bệnh theo sự kết hợp của các kháng thể (được đo là dương tính/âm tính), bằng cách thêm một kháng thể tại một thời điểm, được chọn trong số các kháng thể có liên quan đáng kể đến từng bệnh bằng hồi quy logistic. Như thể hiện trong Bảng 2, model này cung cấp xác suất lý thuyết của bệnh khi có nhiều tự kháng thể liên quan ở một đối tượng duy nhất.

Ví dụ, xác suất mắc SLE là 42,3% khi chỉ có kháng thể anti-dsDNA, tăng lên 52,1% khi anti-Sm cũng dương tính và lên 96,9% nếu cũng phát hiện thấy anti-U1 RNP. Trong pSS, xác suất là 42,8% nếu anti-Ro60 dương tính và đạt giá trị 95,6% khi Ro52 cũng có mặt. 

Trong IIM, xác suất là 89,1% với kháng thể anti-Jo1 dương tính, đạt 99,7% nếu có MSA khác liên quan và 100% nếu cũng có anti-Ro52. Trong SSc, phân tích được thực hiện ở hai dạng lâm sàng của bệnh, cụ thể là lcSSc và dcSSc, có tính đến các kháng thể anti-CENP-B, anti-Scl70 và anti-RNApIII thường loại trừ lẫn nhau.

Trong lcSSc, sự hiện diện của các kháng thể anti-CENP-B cho xác suất là 85,3%; nếu bốn kháng thể (anti-CENP-B, anti-fibrillarin, anti-PM1alfa và anti-U1 RNP) hiện diện cùng lúc, xác suất tăng lên 99,8%. Tương tự như vậy, trong dcSSc, riêng anti-Scl70 cung cấp xác suất là 79,2%, tăng lên 99,2% khi phát hiện bốn kháng thể liên quan đến SSc. Nhóm RNApIII dương tính cho thấy xác suất là 82,3% nếu chỉ có kháng thể này hiện diện, tăng lên 86,1%, 96,2% và 98,6% nếu có một, hai hoặc ba kháng thể khác đồng thời. 

5. Thảo luận

Việc tìm kiếm các tự kháng thể khi có nghi ngờ lâm sàng về CTD là một công cụ có tầm quan trọng lớn cho mục đích chẩn đoán vì nhiều kháng thể có liên quan đến các CTD được xác định rõ và trên hết là vì trong giai đoạn đầu của bệnh, các dấu hiệu và triệu chứng không cho phép chỉ ra một bệnh cụ thể [ 27 ].

Các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm truyền thống đã phân tích một protein tại một thời điểm, đưa ra tầm quan trọng lớn nếu không muốn nói là độc quyền đối với các tự kháng thể cấu thành tiêu chuẩn chẩn đoán phân loại cho các CTD khác nhau. Vì một đặc điểm tiêu biểu của CTD là sự hiện diện của nhiều tự kháng thể [ 28 , 29 , 30 ], nên việc đo lường bộ tự kháng thể có thể đóng góp quan trọng vào việc chẩn đoán sớm CTD. Một ví dụ điển hình là SLE, nguyên mẫu của CTD, trong đó gần 180 tự kháng thể khác nhau đã được mô tả [ 31 ]. Một ví dụ minh họa khác là trường hợp bệnh nhân bị viêm cơ tự miễn. Thay vì là một nhóm đồng nhất, nhiều kháng thể tự miễn được thấy trong viêm cơ tự miễn hiện được cho là có tương quan với các phân nhóm cụ thể có các đặc điểm lâm sàng khác nhau [ 32 ]. Do đó, bộ tự kháng thể thay vì các xét nghiệm riêng lẻ có thể cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán cao hơn.

Ngoài ra, việc phát hiện chúng có thể rất hữu ích cho mục đích tiên lượng và phân tầng rủi ro [ 33 ]. Trong trường hợp này, các hàm ý lâm sàng là rõ ràng, cho phép theo dõi chính xác và kịp thời hơn đối với từng bệnh nhân, thể hiện một bước cụ thể hướng tới việc áp dụng y học cá nhân hóa. Tuy nhiên, các công nghệ hiện có không cung cấp khả năng đo lường số lượng lớn các kháng thể tự miễn và việc thực hiện nhiều bộ tự kháng thể chỉ có thể thực hiện bằng cách sử dụng hai hoặc nhiều phương pháp phân tích, với chi phí và thời gian ngày càng tăng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá và xác nhận một phương pháp phân tích mới dựa trên công nghệ đa phân tích hạt có khả năng đo nhanh một số lượng lớn các kháng thể tự miễn, ở nhiều đối tượng có CTD được mô tả rõ và trong nhiều mẫu đối chứng.

Kết quả cho thấy phương pháp PMAT có độ đặc hiệu rất cao, từ 93,7 đến 100% trong việc phát hiện 29 tự kháng thể là dấu hiệu của CTD. Đây là một phát hiện có tầm quan trọng lớn vì độ đặc hiệu cao là bắt buộc khi nhiều kháng thể được đo đồng thời vì nguy cơ kết quả dương tính giả tăng dần theo sự gia tăng số lượng kháng thể được đo [ 30 ]. Trong nhóm này, độ đặc hiệu thấp nhất (93,7%) được quan sát thấy đối với kháng thể anti-dsDNA. Mặc dù giá trị này khi tính toán đối với bệnh nhân và nhóm đối chứng khỏe mạnh hoàn toàn tuân thủ các yêu cầu của tiêu chí EULAR/ACR [ 5 ], chúng cũng được phát hiện ở 8% trong số 279 bệnh nhân mắc hội chứng Sjögren và ở 5,3% bệnh nhân mắc SSc, mà không có đặc điểm lâm sàng chồng chéo với SLE. Việc đo chính xác các kháng thể anti-dsDNA là một vấn đề đáng quan tâm [ 34 ] và do tính không đồng nhất và đa dòng của phản ứng tự miễn dịch với DNA tự nhiên ở từng bệnh nhân, nên phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phát hiện [ 35 ].

Mục tiêu của nghiên cứu này không chỉ là đánh giá và xác nhận hiệu suất của phương pháp phân tích mới, xác minh độ chính xác chẩn đoán của nó, mà trên hết là xác minh xem có hữu ích khi nghiên cứu một nhóm kháng thể lớn hơn so với nhóm thường được tìm kiếm trong các phòng thí nghiệm lâm sàng hay không. Do đó, các model hồi quy logistic đã được bổ sung bằng các thử nghiệm độ chính xác dự đoán. Sử dụng phân tích hồi quy logistic cho các giá trị kháng thể định lượng, chúng tôi đã chứng minh rằng AUC chẩn đoán cho từng CTD được cải thiện đáng kể bằng cách thêm kháng thể theo cách từng bước. Trong SLE, AUC tăng lên giá trị cao nhất (0,943) khi xem xét bốn kháng thể (anti-dsDNA, anti-Sm, anti-U1 RNP và anti-Ro60 hoặc anti-ribosome P). Điều tương tự cũng được quan sát thấy đối với pSS (AUC 0,867), SSc (AUC 0,958) và IIM (AUC 0,813). Các giá trị AUC cao này cho thấy việc sử dụng bộ tự kháng thể cải thiện độ chính xác chẩn đoán của các xét nghiệm miễn dịch.`

Dựa trên kết quả xét nghiệm, chúng tôi cũng đề xuất một model toán học để tính toán xác suất chẩn đoán bệnh độc lập với các giá trị kháng thể, tức là chỉ xem xét các kết quả lưỡng phân (dương tính/âm tính). Dữ liệu cho thấy việc kết hợp các kết quả dương tính với các kháng thể khác nhau làm tăng xác suất mắc bệnh, do đó bổ sung thêm giá trị đáng kể của bộ tự kháng thể vào chẩn đoán lâm sàng.

Một vấn đề quan trọng khác liên quan đến khả năng sử dụng hệ thống Aptiva như một công cụ sàng lọc. Việc sử dụng bộ tự kháng thể bao gồm tất cả các kháng thể chính liên quan đến CTD có thể cực kỳ hữu ích trong giai đoạn đầu của bệnh, khi các phát hiện lâm sàng còn mơ hồ và chưa cho phép chỉ ra một bệnh cụ thể. Trong loạt xét nghiệm này, xét nghiệm các mẫu dương tính khi phát hiện ít nhất một kháng thể, chỉ có 14,3% mẫu CTD có kết quả âm tính với tất cả các kháng thể, cung cấp độ nhạy chẩn đoán tích lũy của ba bộ là 85,7%. Con số này thấp hơn so với kết quả thu được bằng xét nghiệm ANA HEp-2 IFA cổ điển ở độ pha loãng 1:80 (92%), nhưng tương tự như kết quả thu được bằng HEp-2 IFA ở độ pha loãng 1:160 (82,5%) và đặc hiệu hơn nhiều ở cả hai độ pha loãng (77,0% so với 54,3% ở độ pha loãng 1:80 và so với 66,1% ở độ pha loãng 1:160).

Giới hạn của nghiên cứu này là kết quả thu được khi đánh giá các nhóm đối tượng được chọn và mô tả rõ ràng mắc CTD và điều này có thể không hoàn toàn tái tạo được trong một loạt bệnh nhân chẩn đoán thực tế. Tuy nhiên, vì mục đích của nghiên cứu này, điều cần thiết là các mẫu huyết thanh phải đến từ những đối tượng đáp ứng đầy đủ các tiêu chí phân loại của từng bệnh, để tránh khả năng giải thích sai kết quả xét nghiệm. Một hạn chế khác liên quan đến nhóm đối chứng. Mặc dù nghiên cứu này bao gồm một số lượng rất lớn các đối tượng có tính không đồng nhất cao về bệnh, nhưng vẫn cần có thêm các nghiên cứu để xác nhận độ đặc hiệu rất cao của xét nghiệm miễn dịch PMAT-Aptiva được quan sát thấy trong nghiên cứu này, cũng ở những đối tượng mắc các rối loạn thấp khớp tự miễn không được đưa vào nghiên cứu hiện tại, chẳng hạn như viêm mạch liên quan đến ANCA và hội chứng kháng phospholipid.

6. Kết luận

Đây là nghiên cứu đầu tiên đo được nhiều tự kháng thể như vậy trong CTD bên ngoài lĩnh vực nghiên cứu bằng một công nghệ mới hiện có tại các phòng xét nghiệm lâm sàng. Chúng tôi thấy rằng bảng CTD Essential™ đủ để chẩn đoán SLE và pSS. Sự kết hợp của bảng CTD Essential™ cộng với CTD Comprehensive™ mang lại kết quả tốt nhất cho chẩn đoán SSc và bảng Autoimmune Myositis™ bổ sung bởi Ro52 là bộ tự kháng thể tối ưu để chẩn đoán IIM. Tuy nhiên, vì trong giai đoạn đầu của CTD, việc xác định một bệnh cụ thể không dễ dàng, nên bộ mở rộng thành ba bảng có thể là giải pháp chấp nhận được và có lợi. Hơn nữa, cần lưu ý rằng không có một trong 29 tự kháng thể được thử nghiệm trong bộ này có thể được phát hiện ở 14,3% bệnh nhân trong loạt này. Do đó, có thể bổ sung các kháng thể rất đặc hiệu khác trong tương lai để lấp đầy khoảng trống chẩn đoán còn lại.

Tham khảo:

1. Shiboski CH, Shiboski SC, Seror R, Criswell LA, Labetoulle M, Lietman TM, et al. 2016 Tiêu chuẩn phân loại của Hội thấp khớp học Hoa Kỳ/Liên đoàn chống thấp khớp châu Âu cho hội chứng Sjögren nguyên phát: phương pháp đồng thuận và dựa trên dữ liệu liên quan đến nhóm bệnh nhân quốc tế. Ann Rheum Dis. 2017;76:9–16.

2. van den Hoogen F, Khanna D, Fransen J, Johnson SR, Baron M, Tyndall A, et al. Tiêu chuẩn phân loại năm 2013 cho bệnh xơ cứng hệ thống, sáng kiến hợp tác của Cao đẳng thấp khớp Hoa Kỳ/Liên đoàn chống thấp khớp châu Âu. Ann Rheum Dis. 2013;72:1747–55.

3. Lundberg IE, Tjärlund A, Bottai M, Werth WP, Pilkington C, de Visser M, et al. 2017 Tiêu chuẩn phân loại của Liên đoàn chống thấp khớp châu Âu/Học viện thấp khớp Hoa Kỳ cho bệnh cơ viêm tự phát ở người lớn và trẻ em và các phân nhóm chính của chúng. Ann Rheum Dis. 2017;76:1955–64.

4. Alarcon-Segovia D, Villareal M. Phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh mô liên kết hỗn hợp. Trong: Kasukawa R, Sharp GC, biên tập viên. Bệnh mô liên kết hỗn hợp và kháng thể kháng nhân. Amsterdam: Elsevier; 1987. tr. 33–40.

5. Aringer M, Costenbader K, Daikh D, Brinks R, Mosca M, Ramsey-Goldman R, et al. Tiêu chuẩn phân loại bệnh lupus ban đỏ hệ thống của Liên đoàn chống thấp khớp châu Âu/Học viện thấp khớp Hoa Kỳ năm 2019. Ann Rheum Dis. 2019;78:1151–9.

6. Mariampillai K, Granger B, Amelin D, Guiguet M, Hachulla E, Maurier F, et al. Phát triển hệ thống phân loại mới cho bệnh cơ viêm vô căn dựa trên biểu hiện lâm sàng và kháng thể tự miễn đặc hiệu viêm cơ. JAMA Neurol. 2018;75:1528–37.

7. Vulsteke JB, De Langhe E, Mahler M. Các kháng thể tự miễn ở trung tâm của các vấn đề phân loại (phụ) về phát hiện. JAMA Neurol. 2019;76:867–8.

8. Burbelo PD, Gordon SM, Waldman M, Edison JD, Little DJ, Stitt RS, et al. Các kháng thể tự miễn hiện diện trước khi chẩn đoán lâm sàng bệnh xơ cứng hệ thống. PLoS One. 2019;14:e0214202.

9. Niyhianova SI, Sari A, Harvey JC, Leslie A, Derrett-Smith EC, Fonseca C, et al. Sử dụng kháng thể và phân nhóm da để phát triển phân loại bệnh dựa trên kết quả trong bệnh xơ cứng hệ thống. Viêm khớp dạng thấp. 2020;72:465–76.

10. ter Borg EJ, Horst G, Hummel EJ, Limburg PC, Kallenberg CG. Đo lường sự gia tăng nồng độ kháng thể kháng DNA sợi đôi như một yếu tố dự báo tình trạng bệnh trầm trọng hơn ở bệnh lupus ban đỏ hệ thống. Viêm khớp dạng thấp. 1990;33:934–43.

11. Bootsma H, Spronk P, Derksen R, de Boer G, Wolters-Dicke H, Hermans J, và những người khác. Phòng ngừa tái phát bệnh lupus ban đỏ hệ thống. Lancet. 1995;345:1595–9.

12. Tozzoli R, Bizzaro N, Tonutti E, Villalta D, Bassetti D, Manoni F, et al. Hướng dẫn sử dụng xét nghiệm tự kháng thể trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán và theo dõi các bệnh thấp khớp tự miễn. Am J Clin Pathol. 2002;117:316–24.

13. Mahler M, Bentow C, Serra J, Fritzler MJ. Phát hiện kháng thể tự miễn bằng công nghệ phát quang hóa học. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2016;38:14–20.

14. Cinquanta L, Fontana DE, Bizzaro N. Công nghệ xét nghiệm miễn dịch phát quang hóa học: nó thay đổi điều gì trong việc phát hiện tự kháng thể? Điểm nổi bật của Auto Immun. 2017;8:9.

15. Carbone T, Bizzaro N, Infantino M, Miconi V, Tozzoli R, Antico A, et al. Khảo sát quốc gia thay mặt cho Nhóm nghiên cứu Ý về Tự miễn dịch: tình hình hiện tại của các phòng xét nghiệm tự miễn dịch của Ý năm 2019. Riv It Med Lab. 2020;16:193–206.

16. Bossuyt X, de Langhe E, Borghi O, Meroni PL. Hiểu và diễn giải các xét nghiệm kháng thể kháng nhân trong các bệnh thấp khớp toàn thân. Nat Rev Rheumatol. 2020;12:715–26.

17. Villalta D, Seaman A, Tiongson M, Warren C, Bentow C, Bizzaro N, et al. Đánh giá một xét nghiệm đa phân tích dựa trên hạt tự động mở rộng mới để phát hiện kháng thể tự miễn trong chẩn đoán viêm đường mật nguyên phát. Clin Chem Lab Med. 2020;58:1499–507.

18. Cavazzana I, Richards M, Bentow C, Seaman A, Fredi M, Giudizi MG, et al. Đánh giá một xét nghiệm dựa trên hạt mới để phát hiện kháng thể tự miễn trong bệnh cơ viêm vô căn. J Immunol Methods. 2019;474:112661.

19. Richards M, García-De La Torre I, González-Bello YC, Vázquez-Del Mercado M, Andrade-Ortega L, Medrano-Ramírez G, và những người khác. Tự kháng thể đối với Mi-2 alpha và Mi-2 beta ở bệnh nhân mắc bệnh cơ viêm vô căn. Bệnh thấp khớp. 2019;58:1655–61.

20. Mahler M, Malyavantham K, Seaman A, Bentow C, Anunciacion-Llunell A, Sanz-Martínez MT, et al. bộ tự kháng thể đặc hiệu viêm cơ và điểm số tổng hợp như một công cụ hỗ trợ chẩn đoán phân biệt bệnh cơ tự miễn. Chẩn đoán (Basel). 2021;11:2246.

21. Sciascia S, Radin M, Ramirez C, Seaman A, Bentow C, Casas S, et al. Đánh giá các xét nghiệm mới để phát hiện kháng thể tự miễn trong hội chứng kháng phospholipid. Autoimmun Rev. 2020;19:102641.

22. Radin M, Cecchi I, Foddai SG, Rubini E, Barinotti A, Ramirez C, et al. Xác nhận công nghệ đa phân tích dựa trên hạt để phát hiện kháng thể anti-phosphatidylserine/prothrombin. Y sinh học. 2020;8:622.

23. Radin M, Foddai S, Cecchi I, Rubini E, Barinotti A, Mahler M, et al. Cải thiện độ chính xác lâm sàng ở những bệnh nhân có kháng thể kháng phospholipid bằng cách sử dụng công nghệ đa phân tích dựa trên hạt và miền anti-phosphatidylserine/prothrombin và anti-beta2 glycoprotein I. Thromb Res. 2021;202:100–3.

24. Gaubitz M. Dịch tễ học về các rối loạn mô liên kết. Bệnh thấp khớp (Oxford). 2006;45(Phụ lục 3):iii3–4.

25. Chan EKL. Kháng thể tự miễn dịch Anti-Ro52 thường gặp trong các bệnh thấp khớp tự miễn toàn thân và có mối tương quan với kết quả xấu hơn khi kết hợp với bệnh phổi kẽ trong bệnh xơ cứng hệ thống và viêm cơ tự miễn. Clin Rev Allergy Immunol. 2022. https://doi.org/10.1007/s12016-021-08911-z .

26. McGlasson S, Wiseman S, Wardlaw J, Dhaun N, Hunt DPJ. Bệnh thần kinh ở bệnh lupus: hướng tới phương pháp tiếp cận y học cá nhân hóa. Front Immunol. 2018;9:1146.

27. Mahler M, Meroni PL, Bossuyt X, Fritzler MJ. Các khái niệm hiện tại và định hướng tương lai cho việc đánh giá các kháng thể tự miễn đối với các kháng nguyên tế bào được gọi là kháng thể kháng nhân. J Immunol Res. 2014;2014:315179.

28. Sirotti S, Generali E, Ceribelli A, Isailovic N, De Santis M, Selmi C. Y học cá nhân hóa trong bệnh thấp khớp: model của kháng thể tự miễn huyết thanh. Điểm nổi bật về miễn dịch tự động. 2017;8:10.

29. Fritzler M. Quan điểm: mở rộng phổ và khoảng cách trong xét nghiệm tự kháng thể cho các bệnh tự miễn hệ thống. J Rheumatol Res. 2019;1:10–8.

30. Bizzaro N. bộ tự kháng thể trong các bệnh thấp khớp tự miễn. Mediterr J Rheumatol. 2019;30:86–9.

31. Yaniv G, Twig G, Ben-Ami Shor D, Furer A, Sherer Y, Mozes O, et al. Một vụ nổ núi lửa của các kháng thể tự miễn trong bệnh lupus ban đỏ hệ thống: sự đa dạng của 180 kháng thể khác nhau được tìm thấy ở bệnh nhân SLE. Autoimmun Rev. 2015;14:75–9.

32. Betteridge Z, Tansley S, Shaddick G, Chinoy H, Cooper RG, New RP, et al. Tần suất, tính loại trừ lẫn nhau và mối liên hệ lâm sàng của các kháng thể tự miễn viêm cơ trong một nhóm bệnh nhân viêm cơ vô căn ở châu Âu kết hợp. J Autoimmun. 2019;101:48–55.

33. Cinquanta L, Infantino M, Bizzaro N. Phát hiện kháng thể tự miễn bằng xét nghiệm đa thông số: tác động đến phòng ngừa, chẩn đoán, theo dõi và liệu pháp cá nhân hóa trong các bệnh tự miễn. J Appl Lab Med. 2022;7:137–50.

34. Infantino M, Nagy E, Bizzaro N, Fischer K, Bossuyt X, Damoiseaux J. Kháng thể anti-dsDNA trong tiêu chuẩn phân loại bệnh lupus ban đỏ hệ thống. J Transl Autoimmun. 2021;5:100139.

35. Mummert E, Fritzler MJ, Sjöwall C, Bentow C, Mahler M. Tiện ích lâm sàng của kháng thể kháng DNA sợi đôi và những thách thức trong việc xác định chúng. J Immunol Methods. 2018;459:11–9.

Nguồn: Bizzaro. Arthritis Res Ther. 2022;24(1):278,